大约1600年到1608年期间是莎士比亚的「悲剧时期」，儘管这段时期他还创作了一些「问题剧」如《一报还一报》、《特洛伊罗斯与克瑞西达》和《终成眷属》。
很多评论家认為莎士比亚伟大的悲剧作品代表了他的艺术高峰。第一位英雄当属哈姆雷特王子，可能是莎士比亚创作的角色中被谈论最多的一个，尤其是那段著名的独白——「生存还是毁灭，这是一个值得考虑的问题」。
和内向的哈姆雷特不同（其致命的错误是犹豫不决），接下来的悲剧英雄们奥赛罗和李尔王，失败的原因是做决定时犯下轻率的错误。
莎士比亚悲剧的情节通常结合了这类致命的错误和缺点，破坏了原有的计划并毁灭了英雄和英雄的爱人们。
在《奥赛罗》中，坏蛋埃古挑起了奥赛罗的性妒忌，导致他杀死了深爱他的无辜的妻子。
在《李尔王》中，老国王放弃了他的权利，从而犯下了悲剧性的错误，导致他女儿的被害以及格洛思特公爵遭受酷刑并失明。剧评家弗兰克克莫德认為，「剧既没有表现良好的人物，也没有使观眾从酷刑中解脱出来。」
《马克白》是莎士比亚最短最紧凑的悲剧，无法控制的野心刺激著马克白和他的太太马克白夫人，谋杀了正直的国王，并篡夺了王位，直到他们的罪行反过来毁灭了他们自己。在这个剧中，莎士比亚在悲剧的架构中加入了超自然的元素。
他最后的主要悲剧《安东尼与克丽奥佩托拉》和《科利奥兰纳斯》，包括了部分莎士比亚最好的诗作，被诗人和评论家托马斯斯特恩斯艾略特认為是莎士比亚最成功的悲剧。
在他最后的创作时期，莎士比亚转向传奇剧，又称為悲喜剧。这期间主要有三部戏剧作品：《辛白林》、《冬天的故事》和《暴风雨》。还有与别人合作的《泰尔亲王佩力克尔斯》。
这四部作品与悲剧相比没有那麼阴鬱，和1590年代的喜剧相比更严肃一些，最后以对潜在的悲剧错误的和解与宽恕结束。
一些评论家注意到了语气的变化，将它作為莎士比亚更祥和的人生观的证据，但是这可能仅仅反映了当时戏剧流行风格而已。
莎士比亚还与他人合作了另外两部作品《亨利八世》和《两个贵族亲戚》，极有可能是与约翰弗莱彻共同完成。
目前尚未确定莎士比亚早期的剧作是為哪家剧团创作的。1594年出版的《泰特斯安特洛尼克斯》的扉页上显示这部作品曾被3个不同的剧团演出过。
在1592年到1593年黑死病肆虐后，莎士比亚的剧作由他自己所在的剧团公司在「剧场」（The Theatre）和泰晤士河北岸的「幕帷剧院」（Curtain Theatre）表演。
伦敦人蜂拥到那裡观看《亨利四世》的第一部分。当剧团和剧院的地主发生争议后，他们拆除了原来的剧院，用木料建造环球剧场。这是第一个由演员為演员建造的剧场，位於泰晤士河南岸。